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導(dǎo)讀

益生菌是1 類能夠促進(jìn)宿主腸內(nèi)微生物菌群的生態(tài)平衡， 對(duì)宿主健康及生理功能產(chǎn)生有益作用的活性微生物。本文就益生菌概念、發(fā)展歷史、在食品工業(yè)中的應(yīng)用，尤其是在發(fā)酵果蔬中的關(guān)鍵技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)行綜述，探討益生菌發(fā)酵果蔬關(guān)鍵技術(shù)存在的主要問(wèn)題及未來(lái)發(fā)展方向。

1益生菌的概念

益生菌一詞最先是由Lilly 和Stillwell 在1965 年使用的，他們把益生菌描述為1 種微生物產(chǎn)生的，可以刺激其他微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)，是與抗生素相反的物質(zhì)。1974 年Fark 定義為：益生菌是有利于腸道平衡的有機(jī)物質(zhì)， 這一定義將抗生素也包括在內(nèi)。1989 年Fuller 把益生菌定義為能夠促進(jìn)腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡， 對(duì)宿主起有益作用的活性微生物制劑， 這是目前人們最常用的定義。1994 年有人對(duì)益生菌的定義做了修訂：“益生菌是含活菌和死菌，包括其組分和產(chǎn)物的細(xì)菌制品，經(jīng)口或其他黏膜投入， 旨在改善黏膜表面微生物或酶的平衡， 或者刺激特異性或非特異性免疫機(jī)制”。2001 年，世界糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）將益生菌定義為：通過(guò)攝取適當(dāng)?shù)牧?，?duì)食用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌。目前在世界范圍內(nèi)，學(xué)者們對(duì)其定義還存在著爭(zhēng)議。與益生菌相近的術(shù)語(yǔ)包括微生態(tài)制劑、微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、直接飼喂微生物等。有人認(rèn)為益生菌可為單株，也可為多種菌株的發(fā)酵產(chǎn)物。目前普遍認(rèn)為作為益生菌的細(xì)菌應(yīng)具備以下條件：①對(duì)宿主有益；②無(wú)毒性作用和無(wú)致病作用；③能在消化道存活；④能適應(yīng)胃酸和膽鹽；⑤能在消化道表面定植；⑥能夠產(chǎn)生有用的酶類和代謝物；⑦在加工和貯存過(guò)程中能保持活性； ⑧具有良好的感官特

性。

目前應(yīng)用于食品的益生菌主要有乳桿菌（植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌等）和雙歧桿菌（動(dòng)物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌等）。

2益生菌的發(fā)展歷史

自1899 年法國(guó)Tissier 博士發(fā)現(xiàn)第1株益生菌——雙歧桿菌以來(lái)， 人類對(duì)益生菌的研究已有100 多年的歷史。其間，各國(guó)科學(xué)家不斷對(duì)益生菌進(jìn)行深入研究與探索。1900 年奧地利醫(yī)生莫落驗(yàn)證了人的生老病死和腸道內(nèi)的微生物的密切關(guān)系。1908 年俄國(guó)科學(xué)家伊力亞·梅契尼科夫（Metchnikoff）指出大量發(fā)酵乳制品的攝入與保加利亞人的長(zhǎng)壽密切相關(guān)。1930 年，醫(yī)學(xué)博士代田稔在日本京都帝國(guó)大學(xué)（現(xiàn)在的京都大學(xué)）醫(yī)學(xué)部的微生物學(xué)研究室首次成功地分離出來(lái)自人體腸道的乳酸桿菌，并經(jīng)強(qiáng)化培養(yǎng)，使它能活著到達(dá)腸內(nèi)。這株菌的命名引用代田博士的名字， 即L.casei strain shirota， 也是后來(lái)被稱為養(yǎng)樂(lè)多菌的益生菌。1935 年，乳酸菌飲料“養(yǎng)樂(lè)多”問(wèn)世，益生菌開(kāi)始走上產(chǎn)業(yè)化。1954 年Vergio 比較了腸內(nèi)微生物菌群抗生素與其他抗微生物物質(zhì)的主要作用， 首次介紹了益生菌。1965 年Lilly D. M.和Stillwell R. H.在《科學(xué)》雜志上發(fā)表的論文中最先使用益生菌Probiotic 這個(gè)定義來(lái)描述1 種微生物對(duì)其他微生物促進(jìn)生長(zhǎng)的作用， 首先提出了益生菌的概念， 即益生菌是指對(duì)平衡腸道菌群有益的物質(zhì)或微生物。1989 年英國(guó)福勒博士（Dr. Roy Fuller）將益生菌定義為：益生菌是額外補(bǔ)充的活性微生物， 能改善腸道菌群的平衡并對(duì)宿主的健康有益。他所強(qiáng)調(diào)的益生菌的功效和益處必須經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證。2001 年，F(xiàn)AO/WHO 對(duì)益生菌做了如下定義：通過(guò)攝取適當(dāng)?shù)牧浚瑢?duì)食用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌。2005 年，美國(guó)北卡羅來(lái)納州立大學(xué)Dobrogosz 和Versalovic 教授提出了免疫益生菌的概念（Immunoprobiotics）。近年來(lái)，科學(xué)家相繼從健康人體腸道中分離出雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等多種益生菌株， 并通過(guò)大量的臨床試驗(yàn)證實(shí)了益生菌維持腸道微生態(tài)平衡， 增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種其他正常生理菌群無(wú)法比擬的益生功能。目前，日本、法國(guó)、美國(guó)等國(guó)家的益生菌的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究較為專業(yè)化和系統(tǒng)性， 尤其日本與法國(guó)在益生菌研究與應(yīng)用方面處于領(lǐng)先的地位。日本在20 世紀(jì)60年代開(kāi)始使用益生菌，并較早形成了產(chǎn)業(yè)規(guī)模；以法國(guó)為代表的西歐從20 世紀(jì)70 年代開(kāi)始陸續(xù)有益生菌上市。我國(guó)對(duì)益生菌及與微生態(tài)相關(guān)的基礎(chǔ)理論及應(yīng)用的研究始于上個(gè)世紀(jì)50 年代，并于80 年代成立了微生態(tài)學(xué)的學(xué)會(huì)組織，隨后國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上出現(xiàn)了麗珠腸樂(lè)膠囊、培菲康、媽咪愛(ài)等多種微生態(tài)制品。進(jìn)入21 世紀(jì)以來(lái)，隨著人類生活節(jié)奏的日益加快， 人的飲食和生活習(xí)慣也發(fā)生了巨大改變， 腸道更易受到各種因素的影響而引發(fā)各類腸道疾病?？茖W(xué)家對(duì)益生菌的研究逐步趨向于輔助治療各類疾病， 以及益生菌調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、免疫調(diào)節(jié)機(jī)制、降低膽固醇、預(yù)防癌癥等方面， 更好地說(shuō)明了益生菌對(duì)人類健康所發(fā)揮的巨大作用。

3益生菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用

乳制品是益生菌應(yīng)用最多（高達(dá)70%），也是最為成熟的領(lǐng)域。早在1971 年，日本的MorinageMilk Industry 公司就開(kāi)發(fā)了第1 款含有長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的發(fā)酵乳制品。1978 年，Yakult 公司開(kāi)發(fā)了含有短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的液體酸奶，命名為MilMilTM。1987 年，美國(guó)Mayfield 公司生產(chǎn)出含有1%嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌的非發(fā)酵低脂乳。此后，法國(guó)、德國(guó)、丹麥等歐盟國(guó)家也致力于益生菌乳制品的研究與開(kāi)發(fā)。

目前，益生菌在日本、歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已發(fā)展成為1 個(gè)高度成熟的產(chǎn)業(yè)， 并且開(kāi)發(fā)出多款具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)際知名益生菌株及益生菌乳制品，如丹麥Chr. Hansen 公司的BB12、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus） LA-1 和LA-2 菌株，丹麥Danisco 公司的Howaru 系列菌株， 德國(guó)Biogaia 公司的羅伊氏乳桿菌（L. reuteri）SD2112、MM2 菌株， 芬蘭Valio 公司的LGG 菌株等以及雀巢公司的LC1 優(yōu)酪乳和媽咪go，瑞士EMMI 公司的Aktifit Plus，達(dá)能公司的Activia，荷蘭康必奶公司的Vifit，日本的養(yǎng)樂(lè)多等。在益生菌產(chǎn)品技術(shù)開(kāi)發(fā)方面，我國(guó)與歐美等國(guó)家尚存在差距。近年來(lái)隨著益生菌市場(chǎng)的不斷壯大， 篩選國(guó)產(chǎn)益生菌種并進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用研究，正在逐漸受到國(guó)內(nèi)科技界和企業(yè)界的重視。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)張和平課題組經(jīng)多年研究， 選育出包括干酪乳桿菌（L. casei Zhang）、乳酸雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis） V9、瑞士乳桿菌（L.helveticus）H9 等多株具有優(yōu)良功能的益生菌株，實(shí)現(xiàn)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)功能性益生菌株的重要突破，并與內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)合作，成功將L. casei Zhang 應(yīng)用于多種活性乳酸菌飲料的生產(chǎn)。江南大學(xué)陳衛(wèi)課題組在建立功能性益生乳酸菌篩選模型的基礎(chǔ)上， 篩選出多株擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生乳酸菌，開(kāi)發(fā)了含有功能性益生菌的發(fā)酵乳制品， 并在光明乳業(yè)股份有限公司實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。哈爾濱工業(yè)大學(xué)張?zhí)m威課題組針對(duì)國(guó)內(nèi)乳品行業(yè)優(yōu)良菌株缺乏， 產(chǎn)品中所用菌株生理功效無(wú)法得到保證這一問(wèn)題，聯(lián)合蒙牛乳業(yè)集團(tuán)，選育出了1 株在生產(chǎn)性能方面表現(xiàn)出獨(dú)特性質(zhì)的高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌，并開(kāi)發(fā)出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳品發(fā)酵劑， 這對(duì)后續(xù)研發(fā)適合我國(guó)工業(yè)化生產(chǎn)以及開(kāi)發(fā)功能更加完善的特色酸奶產(chǎn)品意義重大。除益生菌酸奶和發(fā)酵乳飲料外，近年來(lái)益生菌正在逐步被用于開(kāi)發(fā)嬰幼兒奶粉、冰淇淋、冷凍酸奶等各種功能性食品中。隨著我國(guó)益生菌研究的深入以及乳品業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的需要，今后勢(shì)必會(huì)有越來(lái)越多國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的特色益生菌株用于益生菌高端產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

益生菌對(duì)人體腸道功能和免疫調(diào)節(jié)帶來(lái)的良好作用已得到廣泛的認(rèn)同， 這為益生菌的發(fā)展提供了良好的機(jī)會(huì)。近年來(lái)隨著益生菌市場(chǎng)的逐漸壯大，益生菌的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。目前，在全球范圍內(nèi)，益生菌被廣泛運(yùn)用到乳制品、肉制品、發(fā)酵果蔬、發(fā)酵谷物以及保健品行業(yè)中，產(chǎn)品形式擴(kuò)展到片劑、膠囊、顆粒狀包裝的菌體、凍干菌粉以及發(fā)酵乳或果蔬的干燥和凍干粉劑等等， 并逐步形成相對(duì)成熟的市場(chǎng)，銷(xiāo)量逐年上升，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。根據(jù)市場(chǎng)調(diào)研機(jī)構(gòu)BCC 公司發(fā)布的1 份新的市場(chǎng)研究報(bào)告——益生菌市場(chǎng)：原料、補(bǔ)充劑及食品顯示：2007 年，全球益生菌原料、補(bǔ)充劑及食品的市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到149 億美元，2008 年達(dá)到159 億美元，到2013 年達(dá)到196 億美元，年均復(fù)合增長(zhǎng)率（CAGR）為4.3%。由此可見(jiàn)益生菌市場(chǎng)發(fā)展勢(shì)頭之強(qiáng)勁。在過(guò)去的十幾年里，中國(guó)的益生菌市場(chǎng)從無(wú)到有，從單一產(chǎn)品發(fā)展到多元化產(chǎn)品，逐漸形成了一定的規(guī)模， 并一步步走向?qū)I(yè)化和產(chǎn)業(yè)化。

4益生菌在發(fā)酵果蔬中的應(yīng)用

益生菌在發(fā)酵果蔬中的應(yīng)用可追溯到上個(gè)世紀(jì)的60 年代。Pederson 等在1961 年率先將純種發(fā)酵接種技術(shù)應(yīng)用于泡菜的研究。隨后，加拿大考德威爾生物發(fā)酵股份有限公司（Caldwell Bio Fermentation Canada lnc）在1998 年獲得了復(fù)合菌種接種發(fā)酵蔬菜的專利技術(shù)。2001 年，Nancy JGardner 等將植物乳桿菌NK-312、乳酸片球菌AFERM772 和腸膜明串珠菌BLAC 進(jìn)行凍干后復(fù)配，用于胡蘿卜、甘藍(lán)、甜菜和洋蔥混合蔬菜的復(fù)配發(fā)酵菌劑試驗(yàn)。Rodríguez-Gómez 等采用由兩種戊糖乳桿菌復(fù)配而成的復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵西班牙綠橄欖，取得了良好的效果。我國(guó)李幼筠等在1996 年分離出干酪乳桿菌和短乳桿菌， 開(kāi)發(fā)出1種利用純種乳酸菌生產(chǎn)泡菜的工藝， 并申請(qǐng)了發(fā)明專利。西南大學(xué)等單位篩選出的純種乳酸菌菌種可使四川泡菜的發(fā)酵周期由傳統(tǒng)工藝的25d縮短為2d。蔡永峰等在2004 年開(kāi)發(fā)了1 種用于生產(chǎn)泡菜的直投式復(fù)合菌粉產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法，并獲得了發(fā)明專利。隨著益生菌蔬菜發(fā)酵劑研究日漸深入， 國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)企業(yè)開(kāi)始采用直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)泡菜， 給發(fā)酵蔬菜行業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了可喜的增長(zhǎng)。大宗蔬菜的益生菌高效發(fā)酵技術(shù)不僅從根本上解決了傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜存在的食品安全問(wèn)題，穩(wěn)定了產(chǎn)品質(zhì)量，而且大大縮短了泡菜的發(fā)酵周期（將傳統(tǒng)的15～60 d 發(fā)酵周期縮短至2 d 內(nèi)），提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。益生菌發(fā)酵泡菜產(chǎn)品酸鮮可口， 營(yíng)養(yǎng)豐富，天然風(fēng)味濃郁，具有良好的保健功能（富含益生菌和天然植物化學(xué)物）。

近年來(lái)，隨著果蔬深加工技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品認(rèn)識(shí)的不斷深入， 關(guān)于益生菌用于果蔬汁飲料加工中的研究報(bào)道也在不斷增多。采用益生菌生物發(fā)酵技術(shù)開(kāi)發(fā)具有特殊營(yíng)養(yǎng)保健功能的發(fā)酵果蔬汁飲料， 是果蔬深加工技術(shù)的延伸，不僅可以改善果蔬制品的風(fēng)味，增加果蔬制品的醫(yī)療保健作用， 而且大大豐富了果蔬制品的花色品種， 解決了制約果蔬加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。日本、韓國(guó)、德國(guó)等一些國(guó)家都進(jìn)行了發(fā)酵蔬菜汁的研究與開(kāi)發(fā)，尤其是日本，大力開(kāi)發(fā)蔬菜飲料市場(chǎng)，并形成了良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)。2001 年，日本大制藥公司開(kāi)發(fā)出1 款名為“蔬菜的戰(zhàn)士”的植物性乳酸菌發(fā)酵蔬菜汁飲料產(chǎn)品，其中有大蒜、甘薯、南瓜、西紅柿等富含胡蘿卜素的8 種蔬菜，風(fēng)味獨(dú)特，且營(yíng)養(yǎng)豐富，頗受市場(chǎng)歡迎。2010 年，瑞典Skane 公司推出了1 種益生菌果汁， 有醫(yī)學(xué)證據(jù)表明其所含的益生菌可以促進(jìn)女性對(duì)鐵的吸收。Kyung 等以甘藍(lán)汁為原料，接種干酪乳桿菌、植物乳桿菌保加利亞乳桿菌，于30 ℃溫度下發(fā)酵48 h 后， 獲得了含有大量活性益生菌，并且可以緩解乳糖不耐癥的發(fā)酵甘藍(lán)汁。Gardner 等采用胡蘿卜、甘藍(lán)、洋蔥和甜菜的混合果蔬汁分別接種植物乳桿菌、乳酸片球菌、腸膜明串珠菌的單菌及其組合物進(jìn)行發(fā)酵， 有效提高了蔬菜汁的風(fēng)味口感及安全性和耐貯藏性。Filannino 等選用植物乳桿菌接種有機(jī)石榴汁， 開(kāi)發(fā)出1 款風(fēng)味和健康功效俱佳的發(fā)酵石榴汁產(chǎn)品。據(jù)報(bào)道， 自2005 年至今， 全球大約80 多個(gè)發(fā)酵果蔬汁新產(chǎn)品上市，主要集中在日本市場(chǎng)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于乳酸菌發(fā)酵果蔬汁飲料的研究也逐漸增多。張建華的混濁型菜汁飲料是采用保加利亞桿菌、嗜熱乳菌鏈球菌混合，在接種量2%～3%、溫度40℃、脫脂乳含量4%、發(fā)酵16 h 的發(fā)酵模式下生產(chǎn)。張亞雄等采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種進(jìn)行單一果蔬汁及復(fù)合果蔬汁發(fā)酵制作果蔬乳酸發(fā)酵飲料及果蔬乳酸發(fā)酵型果凍。夏其樂(lè)等以楊梅為主要原料，復(fù)配胡蘿卜、番茄榨汁后添加保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，并確定了最佳的發(fā)酵工藝及果汁混合方式。鄒玉紅等以保加利亞乳酸桿菌和嗜熱酸鏈球菌混菌比例1∶1 發(fā)酵蘋(píng)果、胡蘿卜混合果汁，并對(duì)發(fā)酵飲料的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了研究。戈西賽夫等在專利“發(fā)酵蔬菜汁飲料的生產(chǎn)方法及用此方法生產(chǎn)的蔬菜發(fā)酵飲料” 中將多種干燥脫水的蔬菜粉末的混合物漿化、液化、糖化、脫膠，通過(guò)接種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵， 得到適于飲用的蔬菜發(fā)酵飲料。丘裕選用南瓜和火龍果為原料，干酪乳桿菌及植物乳桿菌為菌種， 研究了益生菌在兩種果蔬汁中的發(fā)酵特性以及發(fā)酵果蔬汁在冷藏條件下的穩(wěn)定性。

5益生菌發(fā)酵果蔬關(guān)鍵技術(shù)研究

5.1 發(fā)酵果蔬中微生物的研究

上個(gè)世紀(jì)80 年代，美國(guó)Fleming課題組為更好地指導(dǎo)以圓白菜為原料的酸菜規(guī)?；a(chǎn)，對(duì)自然發(fā)酵酸菜微生物區(qū)系進(jìn)行了研究， 結(jié)果表明以圓白菜為原料的酸菜發(fā)酵包括初始異型發(fā)酵和后續(xù)同型發(fā)酵兩個(gè)階段， 發(fā)酵過(guò)程中的主體微生物為乳酸菌。Fleming課題組通過(guò)對(duì)酸菜發(fā)酵微生物的動(dòng)態(tài)研究， 發(fā)現(xiàn)抑制酸菜發(fā)酵過(guò)早進(jìn)入同型發(fā)酵階段可避免酸菜過(guò)酸， 并產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)。據(jù)此他們篩選了用于酸菜工業(yè)化生產(chǎn)的接種劑——Leuc.mesenteroides 或以 Leuc.mesenteroides為主的復(fù)合微生物?，F(xiàn)已進(jìn)入泡菜工業(yè)化生產(chǎn)成熟期的韓國(guó)， 對(duì)發(fā)酵蔬菜中微生物的研究也有很長(zhǎng)的歷史。Lee 課題組采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)Kimchi 發(fā)酵過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化的分析表明，包括Leuc.mesenteroides，Leuc.gelidum，Leuc.citreum 在內(nèi)的異型發(fā)酵乳酸菌Leuconostoc 在Kimchi 發(fā)酵初期占優(yōu)勢(shì)；在發(fā)酵后期，Lact.curvatus，Lact.Brevis 及Lact.plantarum 等在內(nèi)的乳酸菌（Lactobacillus）迅速生長(zhǎng)，取代其優(yōu)勢(shì)地位。后來(lái)Lee 等又采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)， 發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬（Weissella） 的幾個(gè)種也是Kimchi 中的主要發(fā)酵類群。綜合眾多的研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Leuc.mesenteroides 這種異型發(fā)酵乳酸菌是Kimchi 發(fā)酵過(guò)程中的主要功能乳酸菌，將其應(yīng)用于發(fā)酵可以很好地改善產(chǎn)品的風(fēng)味。目前，韓國(guó)的很多企業(yè)已將其作為接種劑應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。Paramithiotis 等采用PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)西班牙蘆筍自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前5 d 清酒乳桿菌（L.sakei）和糞腸球菌（Enterococcus faecium）為優(yōu)勢(shì)菌群，而綠色魏斯氏菌（W.viridescens）和食竇魏斯氏菌（W.cibaria）主導(dǎo)后期發(fā)酵。

可見(jiàn)， 對(duì)于發(fā)酵微生物區(qū)系進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，可以促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展。作為國(guó)內(nèi)長(zhǎng)期致力于發(fā)酵果蔬研究的課題組， 筆者首次解析了我國(guó)傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律， 發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌腸膜亞種啟動(dòng)整個(gè)發(fā)酵， 隨后是糞腸球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、玉米乳桿菌出現(xiàn)并參與發(fā)酵，最終植物乳桿菌和干酪乳桿菌終止發(fā)酵過(guò)程。此外，還對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中主要發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)代謝機(jī)制及其發(fā)酵功能進(jìn)行了深入研究， 初步闡明泡菜發(fā)酵中存在的多菌種協(xié)同發(fā)酵的代謝控制機(jī)理。筆者課題組在發(fā)酵果蔬微生物的研究中， 選育出1 批植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、腸膜明串珠菌、羅伊氏乳桿菌等具有優(yōu)良果蔬發(fā)酵特性的乳酸菌株，經(jīng)初步的益生功能評(píng)價(jià)后，將這些優(yōu)良菌株搭配用于傳統(tǒng)泡菜的發(fā)酵，其發(fā)酵周期、乳酸產(chǎn)量、感官評(píng)價(jià)等各方面都要優(yōu)于自然發(fā)酵。將菌株搭配接種于胡蘿卜汁等果蔬汁中發(fā)酵， 發(fā)酵后的果蔬汁中不僅增加了大量的營(yíng)養(yǎng)成分，還形成了很好的風(fēng)味。這些研究為我國(guó)果蔬發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

5.2 高活性、低成本的益生菌劑關(guān)鍵技術(shù)研究

5.2.1 益生菌菌體高密度培養(yǎng)技術(shù)

益生菌菌體高密度培養(yǎng)技術(shù)（high cell density culture，HCDC）主要指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝備來(lái)提高單位培養(yǎng)液中益生菌菌體的密度， 并較普通培養(yǎng)方式有顯著提高。1991 年Riesenberg曾指出，理論上大腸桿菌充滿發(fā)酵液的時(shí)候，按照菌體干20%～25%來(lái)計(jì)算， 菌體最高的密度將達(dá)到400 g 細(xì)胞干重/L。外界環(huán)境對(duì)益生菌菌體的生長(zhǎng)代謝有著至關(guān)重要的影響， 無(wú)論是培養(yǎng)基質(zhì)的組成還是溫度、pH值、溶氧量亦或是菌體生長(zhǎng)過(guò)程的限制性代謝產(chǎn)物積累等因素， 都極大地限制了細(xì)菌在培養(yǎng)基質(zhì)中的最大生長(zhǎng)密度。例如乳酸菌在一般的培養(yǎng)基質(zhì)中能夠達(dá)到的最高活菌數(shù)僅為107～108CFU/mL，而向培養(yǎng)基質(zhì)中加入適當(dāng)?shù)木彌_鹽調(diào)節(jié)培養(yǎng)基質(zhì)的酸度， 可使乳酸菌在基質(zhì)中的活菌數(shù)達(dá)到109CFU/mL。1977年Osborne首次使用透析技術(shù)得到10×1010CFU/mL 的活菌數(shù)（相當(dāng)于30～40 g細(xì)胞干重/L）， 而其膜面積耗水量約0.6 m⊃3;/kg。1989 年汪恩浩用國(guó)產(chǎn)中空纖維超濾裝置培養(yǎng)的乳酸菌濃度達(dá)到分批培養(yǎng)的17 倍。1997 年Karah在透析反應(yīng)器聯(lián)合透析模塊的反應(yīng)器中用分批培養(yǎng)的方法得到細(xì)菌密度高達(dá)100 g/L。目前國(guó)外對(duì)乳酸菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)研究通常采用專門(mén)設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器， 采用半透膜與發(fā)酵罐偶聯(lián)技術(shù)， 不斷除去發(fā)酵過(guò)程中積累的限制性代謝產(chǎn)物——乳酸，并將菌體保留在發(fā)酵罐中，實(shí)現(xiàn)菌體的循環(huán)培養(yǎng)，其最高菌體密度可達(dá)到1011CFU/mL， 然而此透析培養(yǎng)方法需要消耗大量培養(yǎng)基，僅限于實(shí)驗(yàn)室水平， 很難擴(kuò)大并運(yùn)用到工業(yè)生產(chǎn)中。目前國(guó)內(nèi)主要采取培養(yǎng)基成分優(yōu)化結(jié)合分批培養(yǎng)或者補(bǔ)料流加培養(yǎng)的方式來(lái)達(dá)到乳酸菌高密度培養(yǎng)的目的， 由此得到的乳酸菌菌體密度一般在109～1010 CFU/mL。筆者課題組采用均衡營(yíng)養(yǎng)、指數(shù)流加等培養(yǎng)方法，植物乳桿菌大罐發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)到1.9×1010CFU/mL。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)張和平課題組采用分批培養(yǎng)方法得到L.casei Zhang最高活菌數(shù)為3.5×1010CFU/mL。吉林大學(xué)王智鼎等在優(yōu)化鼠李糖乳桿菌LGG 培養(yǎng)基配方后，得到活菌數(shù)為9.4×109CFU/mL。寧波大學(xué)曾小群等采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方法，得到戊糖乳桿菌活菌數(shù)為2.36×1010CFU/mL。目前高密度培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)， 不僅增加了單位體積培養(yǎng)液中的菌體數(shù)量， 而且提升了現(xiàn)代化發(fā)酵進(jìn)程，加速了益生菌發(fā)酵劑的商品化進(jìn)程，對(duì)于實(shí)現(xiàn)益生菌發(fā)酵果蔬技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化推廣具有重要而深遠(yuǎn)的意義。

5.2.2 高活性、低成本益生菌劑制備技術(shù)

益生菌高密度培養(yǎng)技術(shù)的建立為后續(xù)高活性益生菌制劑的制備打下良好的基礎(chǔ)。對(duì)益生菌制劑的評(píng)價(jià)除了具備優(yōu)良的益生功能和發(fā)酵活性， 還要確保益生菌制劑在加工、貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性能，并在最大程度上保證菌體的活性。高活性益生菌制劑的制備要在保持益生菌活性的同時(shí)， 盡量移除環(huán)境中的活性水分。除去益生菌所在環(huán)境中活性水分的方法主要有噴霧干燥法和真空冷凍干燥法。噴霧干燥技術(shù)是采用霧化器將濃縮益生菌菌懸液在干燥室內(nèi)造霧， 同時(shí)經(jīng)鼓入的熱空氣與之接觸，瞬間將霧滴中含有的水分帶走。噴霧干燥的效果受進(jìn)風(fēng)溫度影響比較大， 若采用進(jìn)風(fēng)低溫（40～80 ℃）， 設(shè)備利用率和干燥程度都大大降低；若采用較高進(jìn)風(fēng)溫度（80～140 ℃），絕大部分的益生菌尤其是乳酸菌無(wú)法承受高溫， 益生菌干燥粉的活性將大大降低， 報(bào)道顯示國(guó)內(nèi)外使用噴霧干燥技術(shù)制備的細(xì)菌制劑存活率僅有2%～50%。

雖然噴霧干燥的處理效率高于真空冷凍干燥技術(shù)， 但是國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有1 種良好的方法能夠解決這一問(wèn)題， 使得益生菌菌劑的制備都傾向于真空冷凍干燥技術(shù)。高活性益生菌菌劑的制備使得真空冷凍干燥技術(shù)逐漸變得熱門(mén)?，F(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)出規(guī)模化的生產(chǎn)工藝來(lái)滿足日益增加的高活性益生菌菌劑的市場(chǎng)需求。目前使用真空冷凍干燥技術(shù)制備益生菌菌劑的成活率一般都在80%左右。

真空冷凍干燥技術(shù)制備益生菌菌劑時(shí)不可避免地形成冰晶，對(duì)菌體活性也有一定影響。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中， 一般使用冷凍保護(hù)劑來(lái)保護(hù)低溫環(huán)境中的活菌體。該保護(hù)劑可以改變細(xì)菌樣品冷凍干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥和復(fù)水對(duì)菌體的損傷， 同時(shí)提高菌劑貯藏和運(yùn)輸?shù)姆€(wěn)定性。報(bào)道中使用的冷凍保護(hù)劑主要有多元醇、糖、蛋白質(zhì)、肽及氨基酸等。潘艷等的試驗(yàn)表明，海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、山梨醇和乳糖對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)作用最為突出， 乳酸菌存活率達(dá)到78.9%。潘曉琳等在優(yōu)化了7 種保護(hù)劑后，存活率可達(dá)到86%。乳酸菌等益生菌凍干菌粉活菌數(shù)基本在1010CFU/g 左右， 且凍干時(shí)間一般需要30 h 以上。筆者課題組采用專利“1 種兩步干燥法生產(chǎn)高活性乳酸菌劑的方法”，在真空冷凍干燥之前將制備好的乳酸菌菌泥置于真空干燥箱中真空干燥，真空度保持在500 Pa 以下，真空干燥溫度25～45 ℃，真空干燥4 h，然后再真空冷凍干燥。該發(fā)明可顯著縮短真空冷凍干燥時(shí)間，降低能耗，從而有效節(jié)約菌劑制備的成本。此外，菌體的存活率也大大提高， 生產(chǎn)放大后菌劑的活菌數(shù)可達(dá)2.6×1012CFU/g。這項(xiàng)發(fā)明對(duì)制備低成本高活性益生菌劑具有重要意義。

6問(wèn)題與展望

益生菌在果蔬精深加工中的應(yīng)用以往僅限于生產(chǎn)泡菜。近年來(lái)，隨著食品科學(xué)的發(fā)展，益生菌發(fā)酵也逐漸被應(yīng)用于果蔬飲料的生產(chǎn)。值得注意的是， 我國(guó)的益生菌發(fā)酵果蔬關(guān)鍵技術(shù)研究尚存在諸多問(wèn)題。首先，目前益生菌發(fā)酵果蔬汁飲料多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段， 用于果蔬發(fā)酵的乳酸菌多為牛奶發(fā)酵菌株， 而較少采用植物乳桿菌等植物性乳酸菌。由于牛奶發(fā)酵菌株利用果蔬產(chǎn)酸的能力有限且耐酸性很差， 因此不能夠有效地發(fā)酵果蔬原料產(chǎn)生良好的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 這就使得現(xiàn)有乳酸菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品風(fēng)味不夠純正。開(kāi)發(fā)出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的果蔬發(fā)酵專用菌株并用于發(fā)酵果蔬汁飲料，是該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。其次，盡管近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)果蔬發(fā)酵乳酸菌的分離鑒定和一般生物學(xué)特性做了不少研究， 其中是否還存在具有開(kāi)發(fā)潛力的益生菌菌株以及如何將這些益生菌菌株應(yīng)用于發(fā)酵果蔬的生產(chǎn)， 是亟待開(kāi)展的研究課題。在果蔬發(fā)酵專用菌的篩選方面，應(yīng)逐步將高效篩選技術(shù)與科學(xué)的體內(nèi)功能性評(píng)價(jià)體系相結(jié)合， 選育既有優(yōu)良果蔬發(fā)酵特性又有利于人體腸道微生態(tài)平衡的功能性果蔬發(fā)酵專用益生菌株。

此外，在果蔬發(fā)酵劑方面，目前可以用于果蔬發(fā)酵的功能性益生菌發(fā)酵劑產(chǎn)品較少，且活性較低，仍需對(duì)直投式發(fā)酵劑制備中的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出低成本、高活性的發(fā)酵果蔬專用益生菌制劑。最后， 要提高發(fā)酵果蔬制品的穩(wěn)定性，加快方便功能型益生菌發(fā)酵果蔬食品的研發(fā)，大力推進(jìn)益生菌發(fā)酵果蔬制品的產(chǎn)業(yè)化。